Μοριακός Καρυότυπος

H µέθοδος η οποία είναι ευρέως γνωστή ως «µοριακός καρυότυπος» έχει αλλάξει δραστικά το τοπίο στη γενετική διάγνωση και µας επιτρέπει να αντλήσουµε πολύτιµες πληροφορίες για τις χρωµοσωµατικές ανωµαλίες σε πολύ υψηλότερη ανάλυση από αυτή του συµβατικού καρυοτύπου. Στη µεταγεννητική διάγνωση αποτελεί, σύµφωνα µε τις διεθνείς οδηγίες, διαγνωστική εξέταση πρώτης γραµµής για ενήλικα άτοµα ή παιδιά µε ανεξήγητη αναπτυξιακή/νοητική υστέρηση, διαταραχές του φάσµατος του αυτισµού ή πολλαπλές συγγενείς ανωµαλίες. Στην προγεννητική διάγνωση αποτελεί πλέον εξέταση ρουτίνας, κυρίως όταν υπάρχουν υπερηχογραφικά ευρήµατα.

Τι είναι τα χρωµοσώµατα;
Το ανθρώπινο σώµα αποτελείται από δισεκατοµµύρια δοµικές µονάδες που λέγονται κύτταρα. Μέσα σε κάθε κύτταρο υπάρχουν χιλιάδες γονίδια που αποτελούνται από DNA και καθορίζουν το τρόπο λειτουργίας του οργανισµού. Τα γονίδια οργανώνονται τον ένα δίπλα στο άλλο σε δοµές που καλούνται χρωµοσώµατα. Κάθε κύτταρο διαθέτει 46 χρωµοσώµατα ή αλλιώς 23 ζεύγη χρωµοσωµάτων. Τα 22 ζεύγη είναι ίδια στους άνδρες και τις γυναίκες, ενώ το 23ο ζευγάρι καθορίζει το φύλο του ατόµου.

Πώς εξετάζονται τα χρωµοσώµατα;
Η εξέταση των χρωµοσωµάτων γίνεται στο µικροσκόπιο. Με κατάλληλες τεχνικές τα χρωµοσώµατα βάφονται σύµφωνα µε γνωστά πρότυπα και στη συνέχεια µε τη βοήθεια του µικροσκοπίου µεγεθύνονται εκατοντάδες φορές. Η εξέταση ονοµάζεται συµβατικός καρυότυπος και επιτρέπει την αναγνώριση αριθµητικών και δοµικών αλλαγών των χρωµοσωµάτων, εφόσον έχουν αρκετά µεγάλο µέγεθος, ώστε να είναι ορατές στο µικροσκόπιο (τάξη µεγέθους 5-10 Mb) (Εικ. 2). Οι πιο συχνές χρωµοσωµατικές αλλαγές περιλαµβάνουν µεταθέσεις και αναστροφές (αναδιάταξη του ή των χρωµοσωµάτων), διπλασιασµούς (περίσσεια γενετικού υλικού), ελλείµµατα (απώλεια γενετικού υλικού). Η συχνότερη αριθµητική χρωµοσωµατική ανωµαλία στον άνθρωπο µε συχνότητα 1 στις 700 γεννήσεις είναι η τρισωµία 21, κλινική εικόνα της οποίας αποτελεί το σύνδροµο Down.

Μικροελλείµµατα και µικροδιπλασιασµοί
Τα µικροελλείµµατα και οι µικροδιπλασιασµοί αφορούν αλλαγές των χρωµοσωµάτων οι οποίες δεν φαίνονται στον συµβατικό καρυότυπο. Περιλαµβάνουν τµήµατα των χρωµοσωµάτων, όπου είναι δυνατό να εδράζονται από εκατοντάδες γονίδια µέχρι τµήµα ενός γονιδίου. Στην πλειονότητα τους ευθύνονται για σύνδροµα µε σοβαρές κλινικές συνέπειες για τη σωµατική και νοητική υγεία του ατόµου. Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελεί το σύνδροµο di George, το οποίο χαρακτηρίζεται από σοβαρές καρδιακές ανωµαλίες, υπασβέστιαιµία, ψυχοκινητική καθυστέρηση κ.ά. Οφείλεται σε µικροέλλειµµα στο χρωµόσωµα 22 στην περιοχή 22q11.2. Υπολογίζεται ότι 3% των παιδιών µε νοητική υστέρηση και άλλες σοβαρές κλινικές εκδηλώσεις έχουν εύρηµα στο συµβατικό καρυότυπο, ενώ το ποσοστό ανέρχεται σε 15%-20% όταν εφαρµόζεται ο µοριακός καρυότυπος (χρωµοσωµική ανάλυση µε µικροσυστοιχίες, Chromosomal Microarray Analysis CMA).

Πρόκειται για εξέταση η οποία αποτελεί πλέον το χρυσό εργαλείο στην ανίχνευση των χρωµοσωµατικών ανωµαλιών και δίνει τη δυνατότητα ανίχνευσης ελλειµµάτων και διπλασιασµών σε όλο το γονιδίωµα του ανθρώπου, µε διακριτική ικανότητα έως και 1000 φορές µεγαλύτερη από τον συµβατικό καρυότυπο. Επιτρέπει την ανάλυση όλου του γονιδιώµατος για την ανίχνευση (screening) των παραλλαγών του αριθµού αντιγράφων CNVs (Copy Number Variations), οι οποίες έχουν σαν αποτέλεσµα τη δηµιουργία ελλειµµάτων και διπλασιασµών, καθώς και την ταυτοποίηση των γονιδίων τα οποία εδράζονται στις περιοχές αυτές. Στον πίνακα 1 αναγράφονται τα συχνότερα σύνδροµα µικροελλειµµάτων µε τα κλινικά χαρακτηριστικά, τα οποία είναι δυνατό να διαγνωσθούν µε την εξέταση µοριακού καρυοτύπου.

Πλεονεκτήµατα του Μοριακού Καρυοτύπου

• Εξέταση όλων των χρωµοσωµάτων µε µια εξέταση µε µεγάλη διακριτική ικανότητα
• Αποκαλύπτει τα γονίδια που περιλαµβάνονται στα ελλείµµατα και τους διπλασιασµούς
• Βοηθάει στην περαιτέρω διερεύνηση χρωµοσωµατικών ανισοζυγιών, καθορίζοντας τα ακριβή σηµεία θραύσης στο χρωµόσωµα.

Περιορισµοί του Μοριακού Καρυοτύπου

• ∆εν ανιχνεύει µικρές αλλαγές στην αλληλουχία των γονιδίων (σηµειακές µεταλλάξεις), όπως, για παράδειγµα, µεταλλάξεις στο γονίδιο της κυστικής ίνωσης
• ∆εν ανιχνεύει σύνδροµα επέκτασης τρινουκλεοτιδικών αλληλουχιών, όπως, για παράδειγµα, στο σύνδροµο εύθραυστου Χ (fragile X)
• ∆εν ανιχνεύει ισοζυγισµένες αναδιατάξεις των χρωµοσωµάτων, όπως τις µεταθέσεις ή αναστροφές (αλλαγές που δεν περιλαµβάνουν απώλεια ή περίσσεια γενετικού υλικού)
• Είναι δυνατό οι χρωµοσωµατικές αλλαγές τις οποίες ανιχνεύει, οι Παραλλαγές Αριθµού Ανιγράφων CNVs (Copy Number Variants), να αποτελούν φυσιολογικούς πολυµορφισµούς χωρίς κλινική σηµασία. Στην περίπτωση αυτήν κρίνεται απαραίτητος ο έλεγχος των γονιών για την ερµηνεία του αποτελέσµατος. Ειδικά στην προγεννητική διάγνωση είναι δυνατό να υπάρξουν δυσκολίες όσον αφορά την ερµηνεία των αποτελεσµάτων, κυρίως γιατί πρόκειται για ένα αγέννητο παιδί για το φαινότυπο του οποίου έχουµε δεδοµένα µόνο από την υπερηχογραφία. Έχουν αναφερθεί µεγάλα ελλείµµατα ή διπλασιασµοί, ακόµη και της τάξης των 10Μb, χωρίς κλινικές επιπτώσεις. Είναι δυνατόν η ίδια χρωµοσωµατική ανωµαλία να µην προκαλεί κανένα πρόβληµα στον γονέα, ενώ να δηµιουργήσει σοβαρά προβλήµατα στο έµβρυο. Συνεπώς, για την ασφαλή χρήση του µοριακού καρυοτύπου στην προγεννητική διάγνωση θα πρέπει να επιλέγεται το κατώτατο όριο της διακριτικής ικανότητας µε βάση τα διεθνή δεδοµένα των βάσεων καταγραφής και την εµπειρία του εργαστηρίου, να λαµβάνονται υπ’ όψιν τα υπερηχογραφικά ευρήµατα, αν υπάρχουν, να ελέγχονται οι γονείς επί θετικών ευρηµάτων και να γνωρίζει το εργαστήριο το ιατρικό ιστορικό της κύησης.

Σε ποια δείγµατα εφαρµόζεται η εξέταση του Μοριακού Καρυοτύπου;
Ο Μοριακός Καρυότυπος είναι δυνατό να εφαρµοσθεί σε DNA το οποίο αποµονώνεται από:

• ∆είγµατα χοριακών λαχνών ή αµνιακού υγρού κατά την προγεννητική διάγνωση
• Περιφερικό αίµα ενήλικα, παιδιού ή νεογνού
• Ιστούς προϊόντων αποβολής
• ∆έρµα

Ενδείξεις
Αποτελεί εξέταση πρώτης γραµµής για τη διερεύνηση στις παρακάτω περιπτώσεις:

• Κυήσεων µε υπερηχογραφικά ευρήµατα
• Παιδιών ή ενηλίκων µε νοητική υστέρηση/ αναπτυξιακή καθυστέρηση, δυσµορφίες ή συγγενείς ανωµαλίες
• Παιδιών ή ενηλίκων µε ενδείξεις διαταραχών στο φάσµα του αυτισµού
• Καθυστέρηση εφηβείας.

Κλινική σηµασία του Μοριακού Καρυοτύπου
Αποτελεί το χρυσό εργαλείο στη διάγνωση των χρωµοσωµατικών ανωµαλιών κατά τον προγεννητικό και µεταγεννητικό έλεγχο. Το αποτέλεσµα της χρωµοσωµατικής ανάλυσης µε µικροσυστοιχίες είναι δυνατό να βοηθήσει οικογένειες παιδιών µε µη διαγνωσµένα σύνδροµα. Αυτό είναι σηµαντικό για την εξήγηση των κλινικών ευρηµάτων και για τη διαχείριση µε εξειδικευµένες υπηρεσίες. Επιπλέον, σε περίπτωση ευρήµατος, δίνεται η δυνατότητα να εξεταστούν όλα τα µέλη της οικογένειας, προκειµένου να διαπιστωθούν τυχόν φορείς µε κίνδυνο απόκτησης παιδιών µε σοβαρή χρωµοσωµατική ανισοζυγία. Αδιαµφισβήτητη είναι και η διαγνωστική του αξία κατά την προγεννητική διάγνωση. Εν κατακλείδι, ο Μοριακός Καρυότυπος αποτελεί σήµερα την εξέταση µε τη µεγαλύτερη διαγνωστική αξία διεθνώς στη µελέτη των χρωµοσωµατικών ανωµαλιών.

Είναι εξαιρετικά σηµαντικό η εξέταση να εφαρµόζεται σε διαπιστευµένα εργαστήρια µε εµπειρία στη γενετική διάγνωση. Επίσης, απαραίτητη είναι η στενή συνεργασία του εργαστηρίου µε τον θεράποντα ιατρό και κλινικό γενετιστή για την ερµηνεία και για τη συσχέτιση των αποτελεσµάτων µε το φαινότυπο του εξεταζόµενου ατόµου ή των υπερηχογραφικών ευρηµάτων κατά την κύηση. Η εξέταση εφαρµόζεται στο διαπιστευµένο κατά ISO15189 εργαστήριο Μοριακής Γενετικής της Βιοιατρικής, όπου παρέχεται και η απαραίτητη γενετική συµβουλή από εξειδικευµένους γενετιστές.

 Το κόστος για την εξέταση Μοριακού Καρυοτύπου ατόμου είναι 300€ και γονέων ή ζεύγους 550€.